Dosage des anticorps IgG anti-tréponèmes par immunofluorescence indirecte. FTA  Abs  Test .

1. Principe de l'immuno-fluorescence indirecte ( IFI ).
________________________________________________________________________

Les éléments du dosage des IgG anti-trépo par IFI.
___________________________________________________________________________________
 
 
 

Les 3 étapes du principe du dosage des IgG anti-tréponèmes par IFI :
____________________________________________________________________________________

1	2	3
Fixation des Anticorps sur les tréponèmes.	Fixation du conjugué sur la partie Fc (chaînes gamma) des IgG.	Observation de l'émission  de fluorescence.

____________________________________________________________________________________
 

2. Conditions à respecter vis-à-vis du sérodiagnostic de la syphilis par IFI. FTA Abs Test.
________________________________________________________________________________________________

Rappel du principe du test FTA Abs :

Les sérums à analyser sont traités par une solution d'antigènes de la souche REITER non pathogène,
de façon à éliminer les anticorps non spécifiques de la souche Nichols pathogène ( celle qui déclenche la Syphilis ) .

Conditions à respecter :
 

• Les sérums à analyser doivent être traités par un absorbant qui élimine les anticorps dirigés contre des déterminants antigéniques communs à la souche non pathogène : treponema pallidum souche REITER.

La dilution introduite alors est au 1 / 5 ; par exemple 50 µl de sérum + 200 µl de sorbent.
 

• Le tampon de dilution qui est ensuite utilisé est le BABS ( solution tapmon phosphate + albumine bovine ).

On réalise :
soit des dilutions standards des sérums inconnus, en petit nombre :
                          1 / 5 dans le sorbent et 1 / 200 en rediluant ensuite avec du BABS,
soit une gamme de dilutions.
 

• Le sérum de contrôle est testé de façon systématique avec un groupe d'analyses à mener.

Remarque pour le TP en labo de lycée :
on peut évoquer ces conditions, et ne pas les appliquer sachant que le SEROTROL de Bio Mérieux ne contient que des anticorps spécifiques de la souche NICHOLS.
Dans ce cas, on propose aux élèves une gamme de 5 dilutions du sérum étalon ( le SEROTROL de Bio Mérieux )
et une gamme de 5 dilutions d'un sérum déclaré inconnu ( en fait l'étalon SEROTROL, mais dilué au 1/4 ou 1/8 dans du BABS).
 

• Le conjugué doit être testé par le labo pour déterminer la bonne dilution de travail.

3. Témoins à réaliser.

Cependant en tenant compte de l'utilisation du sorbent, il conviendra de réaliser les témoins suivants en s'inspirant de la fiche Trépo Spot IF de Bio Mérieux :
 

• n1= Témoin conjugué : 10 µl de BABS à la 1ère étape,       10 µl de conjugué à la 2 ème étape.
• n2= Témoin sorbent :   10 µl de sorbent à la 1 ère étape,       10 µl de conjugué à la 2 ème  étape     .
• n3= Témoin SNS ( sérum négatif ) dil au 1 / 5 dans sorbent :
•                                         10 µl sns 1ère étape,                     10 µl conjugué 2 ème étape
• n4= Témoin SNS ( sérum négatif ) dil au 1/5 dans BABS : idem
• n5= Témoin sérum X à analyser dil au 1/5 dans sorbent :
•                                    10 µl sérum X au 1/5 dans sorbent 1ère étape, 10 µl conjugué 2 ème étape
• n6= Témoin sérum X à analyser dil au 1/5 dans BABS :
•                                    10 µl sérum X au 1/5 dans BABS 1ère étape, 10 µl conjugué 2 ème étape

Ne pas oublier de réaliser la gamme de dilutions pour le sérum X : ce sérum pouvant être l'étalon sérotrol Bio Mérieux pur.

n7 à n12 = gamme de dilution du sérum X dans BABS à partir of course if you have understood ( not yet ? )
de la dilution dans le sorbent au 1/5 pour avoir la collection suivante 1/50 à 1/ 1600.

Bref vous comprenez qu'on réalise une collection de témoins sans fluorescence pour les n°1, 2, 3, 4,

La fluorescence doit être de même intensité pour n5 et n6 afin de vérifier l'absence d'Ac non spécifiques de la souche Nichols.
________________________________________________________________________________________________
 
 
 

4. Manipulations.
________________________________________________________________________________________________
 

Dépôts des anticorps :  10 µl de chaque dilution  ou 10 µl de chaque témoin sur chaque emplacement  du support.	Incubation  en chambre humide 30 minutes  à 37 ° C .	Egoutter les dépôts délicatement, avec des gants. Jeter le papier filtre  dans un bac d'eau de Javel.	Lavages : 2 fois 5 minutes  dans 2 bacs différents.

___________________________________________________________________________________
 

Dépôt du conjugué  préparé au 1 / 100 :  10 µl sur chaque emplacement du support.	Incubation  en chambre humide 30 minutes  à 37 ° C .	Egoutter les dépôts délicatement, avec des gants. Jeter le papier filtre dans  un bac d'eau de Javel	Lavages : 2 fois 5 minutes  dans 2 bacs différents.

___________________________________________________________________________________
 

Microscope  à  immunofluorescence. Observation.	Tréponèmes fluorescents Objectif x 100 à l'immersion dans l'huile.

_______________________________________________________________________________
 

5. La fiche de TP pour les BTS AB 2ème année :
________________________________________________________________
 

Dosage des anticorps anti-tréponèmes par immunofluorescence indirecte.

 Le but de la séance sera de réaliser une gamme de dilutions pour le sérum étalon,

 (vérification du titre de l'étalon sérotrol)

 et de réaliser certains témoins : conjugué et sorbent.

1. Préparation des sérums :

• Sérum étalon : SEROTROL Bio Mérieux.

Diluer le sérum étalon sérotrol au 1 / 5 dans le sorbent : 40 µl sérotrol + 160 µl sorbent.

Diluer ensuite au 1/10 dans du tampon BABS : 20 µl sérotol déjà dil au 1/5 dans sorbent + 180 µl tampon BABS

on obtient alors 200 µl de sérotrol au 1/50.
Ensuite, à l’aide d’une microplaque, réaliser les dilutions finales suivantes :

dilutions	1 / 100	1 / 200	1 / 400	1/ 800
Tampon BABS	50 µl	50 µl	50 µl	50 µl
Sérum dil 1/50	50 µl	*	*	***

 * : reporter dans la cupule suivante 50 µl.  *** : jeter dans le javel 50 µl.

• Sérum étalon dilué au 1/5 dans tampon BABS : 40 µl sérum sérotrol + 160 µl BABS

• Sérum SNS dilué au 1/5 dans le sorbent.
• Sérum SNS dilué au 1/5 dans le BABS.

2. Mode opératoire :

La lame est organisée en 2 séries de cercles numérotés ; elle est déjà recouverte par une suspension de tréponèmes .

 

N°	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
	Sérum étalon					Les témoins
dilutions Témoins	1 / 50	1 / 100	1 /200	1 / 400	1 / 800	T-conjugué 10µl  BABS	T-sorbent 10µl  sorbent	T-sérotrol 10µl séro dil 1/5 dans sorbent	T-sérotrol 10µl séro dil 1/5 BABS	T-SNS 10µl sns dil 1/5 dans sorbent
	Déposer 10 µl de chaque dilution / cercle					Déposer 10 µl de chaque témoin / cercle
	Incuber à 37 ° C (étuve) pendant 30 minutes en chambre humide ( Boîte de pétri + papier imbibé d’ eau )
	Eliminer l’excès de sérum ( gants + papier filtre + javel ) avant de laver 5 minutes dans le tampon PBS. Laver une seconde fois pendant 5 minutes dans le PBS dans une autre cuve.
	Déposer 10 µl de conjugué ( dilué au 1 / 100 dans tampon BABS ) dans chaque cercle. Incuber à 37 ° C (étuve) pendant 30 minutes en chambre humide ( Boîte de pétri + papier imbibé d’ eau ) Eliminer l’excès de conjugué ( gants + papier filtre + javel ) avant de laver 5 minutes dans le tampon PBS. Laver une seconde fois pendant 5 minutes dans le PBS dans une autre cuve. Egoutter, laisser sécher à l’air, lire l’émission de fluorescence (verte) au microscope had hoc. L’objectif 100 à immersion est utilisé. Placer 1 goutte d’ huile sur les n° 2 et 7.
Lecture

3. Résultats :

Titre en fluorescence retenu pour le sérum étalon :

Noter l'intensité de fluorescence pour chaque témoin, conclure.
 
 

________________________________________________________________________________________________

6. Résultats.
 

N°	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
	Sérum étalon					Les Témoins
dilutions	1 / 50	1 / 100	1 /200	1 / 400	1 / 800
Lecture	+++	++	++	+	+	-	-	+++	+++	-

Titre en fluorescence retenu pour le sérum étalon : 800.

Remarque : dans le cas présent, les résultats sont exprimés en inverse des dilutions,

                     il n'y a pas d'expression en unités internationales / ml de sérum.

T conjugué : pas de fluorescence.
T sorbent : idem.
T sérotrol 1/5 dans sorbent et T sérotrol 1/5 dans BABS :
même intensité de fluorescence, ici assez forte car la dilution est peu poussée.
T sns : pas de fluorescence.

________________________________________________________________________________________________

7. Interprétations.
___________________________

________________________________________________________________________________________________

Vous pouvez proposer un scénario à vos élèves , soit une Syphilis I, soit une Syphilis II,

en vous inspirant d'autres tests comme ceux du TPHA et du VDRL.

La partie interprétation est un prétexte à revoir ou à présenter le sérodiagnostic de la Syphilis par différentes méthodes.

Pensez aussi à vous inspirer des sujets d'examens : BAC STL ou BTS AB.
________________________________________________________________________________________________